摘要
定量聚合酶链反应(qPCR)分析具有高灵敏度，这是其成功并广泛应用于科学实验室的最重要原因之一。然而，包括移液技术在内的许多因素都会对qPCR分析的结果产生影响。PCR Master Mix 通常在qPCR准备期间使用，但可能很难对其进行准确移液。在本研究中，我们测试了在qPCR中使用电动移液器移取Master Mix。研究证明，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头或标准滤芯吸头对Master Mix移液，可获得良好的精准性，并能确保移液速度及结果的重现性。从而得出结论，在进行基于PCR的分析时，使用电动移液器移取Master Mix确保得到可重复且可靠的结果。
引言
基于PCR的应用已成为生物制药工艺、临床诊断和学术研究的关键手段。然而，在执行定量聚合酶链反应(qPCR)时，实验结果的可变性可能是个问题，移液误差是需要重点关注的变化来源之一。在qPCR准备阶段，对Master Mix试剂进行移液具有挑战性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含吐温和甘油成分的缓冲液组成。
本应用说明的目的是测试在PCR分析应用中使用电动移液器移取Master Mix的可靠性。在定量PCR准备阶段，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头来移取Master Mix，实验结果(定量循环，Cq)由准确度和精准度(重现性)来进行评价。
方法
移液器和移液器吸头选择
使用Picus®电动移液器、Safetyspace低吸附滤芯吸头和滤芯吸头。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix时，将电动移液器速度参数设置为1。
qPCR准备
qPCR准备阶段使用Picus®电动移液器、Safetyspace滤芯吸头及低吸附滤芯吸头。Lo-Bind EP管用于DNA样品制备及Master Mix的制备。制备用于所有测试的PCR Master Mix储备液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix(不含ROX)、大肠杆菌uidA基因引物以及无核酸酶水。
用移液器将八个 15μL 的Master Mix重复样品移取至PCR板孔中，用于各种测试条件。无模板对照(NTC)样品不含大肠杆菌基因组DNA，并加入 5μL 无核酸酶水。用类似方法移取 5μL 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 个拷贝丨反应大肠杆菌gDNA的系列稀释标准品。
在每个测试孔中有 5μL 含有1×103 个拷贝丨反应的大肠杆菌gDNA。使用Picus® 电动移液器的多次分液功能及低吸附滤芯吸头以相同的方式将所有DNA样本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR仪进行qPCR。循环参数如下：在 95°C下预培养 10 分钟，随后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循环。
对标准品、对照品和样品中的SYBR绿色荧光激发进行定量。使用LightCycler® 480软件确定定量循环(Cq)值和实际拷贝数，并使用MS Excel分析结果。
数据分析
Cq值的百分比系统误差(%S)反映了处理Master Mix的仪器系统(移液器和吸头系统)Cq值的误差。移液过程中的随机误差是结果精准度的测量，反映了实验中重复样品之间的差异。Cq值的百分比随机误差(%R)反映了结果的重现性，并且可能受到实验人员移液操作的影响。
结果
如图1所示，当使用低吸附滤芯吸头移取Master Mix 时，电动移液器的多次分液模式所得结果为：Cq=24.54±0.09、Cq的百分比系统误差=0.12、Cq的百分比随机误差=0.37;相比之下，采用标准滤芯吸头所得结果为：Cq=24.52±0.16，Cq的百分比系统误差=0.04，Cq的百分比随机误差=0.67。
在这两种情况下，使用电动移液器所得的结果都具有良好的重现性(百分比随机误差)，且Cq值的百分比系统误差均保持在低水平。电动移液器的多次分液模式可确保通过一次吸液后，将Master Mix按顺序分配到所有八个重复孔中，显著提高了移液速度也减少了移液器吸头的使用数量，更环保的同时也减少了更换吸头造成的差异。
讨论
研究证明，在PCR准备阶段使用电动移液器可以得到出色的结果，结果的百分比误差很低。与标准滤芯吸头相比，使用电动移液器的多次分液模式搭配低吸附滤芯吸头可提供更好的结果。对于仍使用标准移液器吸头移取Master Mix的实验室来说，多次分液搭配标准滤芯吸头可提供次佳的结果重现性(精准度)。
Conclusion
基于PCR原理的实验中使用电动移液器移取Master Mix可确保高准确度和精准度。此外，电动移液器可加快完成实验的速度，减少移液所需的时间，使操作更符合人体工程学。因此，使用电动移液器可以降低实验室工作人员患上重复性劳损(RSI)的可能性，并使实验更不容易出错，它还能在相同的实验中使用更少的移液器吸头，因此也是更环保的选择。
